采用點(diǎn)光源照射標(biāo)本，在焦平面上形成***個(gè)輪廓分明的小的光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有***個(gè)針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸***致，約１００－２００ｎｍ；相對于焦平面上的光點(diǎn)，兩者是共軛的，即光點(diǎn)通過***系列的透鏡，***終可同時(shí)聚焦于照明針孔和探測針孔。
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這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內(nèi)，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點(diǎn)掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點(diǎn)獲得對應(yīng)光點(diǎn)的共聚焦圖像，轉(zhuǎn)為數(shù)字信號傳輸至計(jì)算機(jī)，***終在屏幕上聚合成清晰的整個(gè)焦平面的共聚焦圖像。
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